食管癌预后评价及疗效预测分子靶标

 

　　p53基因突变

 

　　p53基因定位于人类染色体17p13.1，全长20kb的核内磷酸化蛋白，是体内重要抑癌基因,和细胞周期调节基因。食管癌p53突变发生率约50%-80%，最常见到的是A:T基因位点的突变。p53基因突变后发挥癌基因的作用,导致食管癌细胞周期失控，增加浸润转移危险性；影响放化疗疗效；一定程度提示患者不良预后。Murtaza等发现，突变型p53食管鳞癌细胞表达与分化程度有关，高分化鳞癌组织p53低表达，而低分化鳞癌组织p53高表达。

 

　　p53突变与食管癌不良预后密切相关，尤其是食管鳞癌，p53基因发生突变之后会放纵肿瘤细胞的生长，往往这些患者的预后比较差。Makoto等【2】通过野生型p53和突变型p53表达的对比研究，结果显示患者三年和五年的生存率分别为48.6%VS17.9%，和43.8%VS15.3%，提示突变型p53的表达与肿瘤患者的不良预后有关。Takahaski等【23】所进行的119例进行了食管切除术的食管癌病例的研究显示患者的不良预后与p53基因的突变有相关性，而p53-MDM2通路在体内的水平与预后并无明显相关性。提示p53的表达情况（是野生型表达或是突变型表达）可能和食管癌患者的预后有关。Lagarde等【24】的关于食管腺癌的研究显示肿瘤的发展过程是一个多因素作用的结果，单一的因子并不能够对食管癌患者做全面的预后估计，然而突变型p53的表达可能是预测效果较好的一种影响因子。David等对波士顿的371位食管癌患者的研究显示【25】在研究期间的33个月里突变型p53表达与不表达突变型p53的患者中位生存期分别为11.8月和29.1月（P<0.0001）。提示突变型p53的表达与食管癌患者的生存率降低有关。

 

　　较多作者报道术前食管癌组织p53蛋白或/和血清中p53-Ab阳性的食管癌患者术前放化疗敏感性和预后均差。尽管尚无最终的定论，目前接近公认突变型p53过表达可降低食管癌患者的化放疗效果，并且对其机制做了进一步探索。Makino等研究64例疗前食管鳞癌，野生型p53表达能增强放疗和化疗敏感性，突变型p53由于失去诱导细胞凋亡作用，因此导致放疗和化疗敏感性下降。Hritz等免疫组化法分析51例标本，p53基因状态(野生型和突变型)是影响疗效更为关键的因素。Yang等对100例食管癌患者研究，p53突变高表达者化疗耐药性提高，机制与survivin也高表达有关。。日本学者Yamasaki等研究了77例化疗前的食管癌患者，其结果显示对化疗敏感性反应中突变型p53和野生型p53的比例分别是16.7%和65.9%，提示突变型的p53使肿瘤细胞对化疗敏感性有降低的趋势【2】。Kirsch等对于放疗效果的研究提示，放疗损伤DNA在野生型p53作用下引起肿瘤细胞凋亡，突变型p53则无法诱导肿瘤细胞的凋亡【19】【20】，从而导致放疗敏感性减弱。Drakos等的食管癌小鼠动物研究证实，修复野生型p53功能后小鼠肿瘤对放疗治疗的反应性提高【21】。

 

　　EGFR家族基因过表达

 

　　表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptorEGFR）家族属于Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，包括EGFR、Her-2、Her-3、Her-4四个成员，分别是原癌基因C-erbB-1～4的表达产物。食管癌组织稳定过表达EGFR家族，与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、血管生长及细胞凋亡抑制有关。

 

　　EGFR家族在食管鳞、腺癌组织中均稳定表达。食管鳞癌（squamouscellcarcinomasoftheesophagusESCC）EGFR过表达率40%-80%。正常食管粘膜，食管上皮轻、中、重度不典型增生，以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分化ESCC的EGFR阳性率从0逐步递增达80%左右，认为EGFR阳性表达率随食管黏膜恶变的发生发展进程而明显增加。ESCC过表达Her-2文献报道7.7-65%，多数作者认为Her-2过表达率在30%以内。约50%的食管腺癌（esophagealadenocarcinomaEAC）存在稳定的EGFR过度表达状态，与肿瘤恶性程度呈正相关。低分化EAC过表达EGFR发生频度高。食管腺癌her-2过表达率约为10%--20%，个别研究结果高达50%。Her-3过表达与食管癌分化程度及局部淋巴结的转移有相关关系，与年龄，性别，肿瘤的大小，部位和浸润深度之间的关系不大。食管癌组织Her-4表达研究文献罕见。

 

　　多数研究者认为食管癌EGFR过表达与发生转移、较短生存期等预后不良特征密切相关，认为EGFR家族过表达可做为食管癌预后因子。局部淋巴结转移者的EGFR阳性率高于无局部淋巴结转移者（P﹤0.05）；远处转移者EGFR阳性率高于无远处转移者（P﹤0.05）。ESCC过表达Her-3也与食管癌淋巴道转移存在一定的关联[24]。可能与食管癌组织高表达EGFR引起细胞分化异常，致细胞间粘附力下降，表现为e-cadherin表达缺失有关。也有人认为EGFR过表达至少还不能成为食管癌独立预后因子。Her-2过表达与抑制凋亡、促增殖、增强肿瘤转移潜能相关联，会通过诱导血管内皮生长因子的表达，促肿瘤血管形成，Her-2基因扩增有望独立做为ESCC的预后不良提示因子。

 

　　ESCC的Her-2过表达率较低，但较为稳定，与临床分期和恶性程度似乎存在一致性，是潜在的食管癌预后评价因子。Her-2的过表达状态与基因扩增存在明确的一致性，而Her-2基因扩增是ESCC病人预后不良的提示因子。初步研究认为食管癌组织Her-3过表达率约60%，可能与癌细胞分化及局部淋巴结转移相关，而Her-4过表达则可能与肿瘤病理分期、淋巴结转移及生存相关。

 

　　EGFR家族各成员食管癌组织中表达是潜在的化疗敏感预测因子。Masahiro等用5-Fu、顺铂同期联合放疗（常规分割，总量60Gy）治疗62例ESCC，内镜评估放化疗反应。21例表达EGFR病例，13例(13/21，62%)CR，相比之下，未表达EGFR的41例患者仅14例(14/41,34%)CR，差异显著(P=0.037)，多因素回归分析显示只有EGFR对放化疗敏感性具预测作用。AkamatsuM等则认为her-2过表达似与食管癌放化疗抵抗有关(p=0.02)。

 

　　食管癌组织过表达VEGF

 

　　VEGF表达水平直接反映肿瘤生长速度和转移倾向。VEGF家族有VEGF-A,-B,-C,-D,-E和PIGF，其中VEGF-A(通常称作VEGF)是该家族的最基本成员，是功能最强的内皮生长因子，与VEGF-C,-D一起被认为与肿瘤关系密切；VEGF-A使实体瘤血管化、促进肿瘤生长还参与了肿瘤的血道转移；VEGF-C,D结构相似，能促进实体瘤淋巴管形成和淋巴道转移（淋巴生长因子）。VEGF蛋白在正常食管粘膜组织、癌周邻近组织和ESCC组织中表达各异，表达率也呈逐步递增势态。林丹霞等免疫组化法分析60例ESCC组织、20例癌旁组织、10例正常食管黏膜，VEGF表达阳性率分别为：36.7%、15.0%、10.0%，差异具统计学意义(p<0.05)。ESCC组织VEGF-C，-D也呈过表达状态。PanX.F.等QRT-PCR法检测VEGF-CmRNA显示：ESCC组织表达明显高于正常食管粘膜组织(6.30vs2.81，p=0.02)。

 

　　多项国内外研究结果提示，食管癌组织VEGF过表达率60-80%，且与低生存率、高的肿瘤分期、淋巴转移联系密切(p<0.05)，具有评估ESCC预后潜在价值。TakayukiKii等却有不同的看法，免疫组化法检测51例II,III期ESCC患者同期放化疗前癌组织VEGF表达情况与患者中位生存期关系，尽管“低表达组：669天，高表达组：352天”(p=0.0474)，但进一步单因素回归分析并未发现VEGF表达差异对患者预后影响具有显著意义（p=0.0515）。多项研究的多因素回归分析均提示：肿瘤组织VEGF-C表达是评估淋巴结转移复发、短生存期的独立相关因子，预示预后不良，VEGF-C阳性可独立预测患者预后，认为VEGF-C表达是ESCC患者预后因子。数项国内外研究cox回归分析提示，血清VEGF（S-VEGF）浓度是仅次于临床分期的独立预后因素，疗前S-VEGF水平影响患者预后并可能作为一个独立预后因子。MiroslawKozlowski等分析110例ESCC患者，术前高血清VEGF-C浓度组术后复发率明显高于低水平者，高浓度血清VEGF-C是患者术后复发和评估淋巴结转移的一个独立危险因子，患者术前检测血清VEGF-C浓度在预测复发方面有重要作用。多因素回归分析VEGF-D能独立预测患者术后生存(HR1.73895%CI1.035-2.920p=0.035)，认为VEGF-D是ESCC患者术后生存期独立预测因子。

 

　　胡秀峰ELISA法检测38例ESCC患者血清S-VEGF浓度：化疗有效者S-VEGF水平明显下降(560.50&plusmn;264.30pg/mlvs396.80±165.00pg/ml，p<0.01)；化疗无效者S-VEGF水平变化则不明显(597.40±261.20pg/mlvs568.60±290.30pg/ml，p>0.05)，认为化疗前后血清VEGF浓度变化与化疗近期疗效密切相关。M.Orditura等在45例接受新辅助化疗ESCC患者临床研究中发现，血清S-VEGF浓度与新辅助化疗效果相关：治疗有反应组(CR+PR)浓度明显低于无反应组(SD+PD)(315.3±95.3vs689.58±132.1pg/mlp=0.001)。H.Ariga等分析了39例可切除ESCC患者治疗前活检标本，治疗方案为：顺铂+5-FU加60Gy的同期放化疗。完全反应率76.3%，局部控制率44.7%。随访47.8月后3年总体生存率65.8%，5年总体生存率63.2%，单因素回归分析和多因素回归分析均显示VEGF过表达预示局部控制不良。

 

　　Bmi-1基因与食管鳞癌的关系

 

　　原癌基因Bmi-1(B-cell-specificMoloneymurineleukemiavirusinsertionsite1，B细胞特性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点1)在1991年被首次报道，它属于polycomb家族，直接参与细胞生长、增殖的调节，并为成体干细胞和白血病干细胞的自我更新所必需。研究证实人类多种肿瘤的发生、发展过程均与Bmi-1基因表达异常有关。人类Bmi-1基因位于第10号染色体短臂1区3带(10p13)，其结构与鼠基因非常相似，含有14个外显子和10个内含子。

 

　　研究发现，Bmi-1在胚胎期对神经干细胞（NSC）的自我更新过程起重要作用。从胚胎期到成人期，神经祖细胞的增殖和发育越来越依赖于Bmi-1。在体外它还可以促进鳞状细胞癌发生。另外，Bmi-1表达导致肿瘤抑制因子如p16INK4a和p14ARF，细胞粘附分子如E-钙粘蛋白，分化相关因子如KRT6等表达下调。研究还发现，Bmi-1表达失调可以导致角质化细胞变质、肿瘤化，可能机制是缩短细胞周期和增加细胞移动性。

 

　　Xiao-TingHe【37】等用实时定量PCR和免疫组化对石蜡包埋的食管鳞癌组织研究发现，Bmi-1mRNA和蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的表达明显高于邻近非肿瘤组织，这表明Bmi-1在食管鳞癌的发展过程中扮演重要角色，具有诊断价值。研究还发现，Bmi-1的表达水平与性别、年龄、淋巴结转移以及病理类型无关，与细胞分化和病理分期有关。Bmi-1的表达在食管鳞癌的发生阶段不是必须的，但在进展过程中是必须的。在食管鳞癌组织中，Bmi-1大部分存在于细胞质，细胞核中含量很少甚至没有，所以我们能通过检测组织细胞浆中的Bmi-1含量了解肿瘤的生长状况。

 

　　HuangSD【38】等发现，在食管鳞状细胞癌干细胞p75NTR+细胞中，Bmi-1表达显著增高。Dirks等[39]报道，Bmi-1含量低的肿瘤攻击性可能更弱，因为含有的干细胞更少。通过研究，Xiao-TingHe[37]等发现肿瘤分化越低，肿瘤组织中的Bmi-1癌蛋白的含量越高。在Ⅰ/Ⅱ期组织中的Bmi-1mRNA含量明显低于Ⅲ/Ⅳ期，无淋巴结转移者较淋巴结转移者明显减低，与细胞分化程度呈负相关。研究还发现，在食管鳞癌患者中，Bmi-1高表达者OS较低表达者更短。许多研究显示【40，41】Bmi-1表达是一个潜在逃避机制，与术后治疗失败、疾病复发有关。QinL[42]等发现Bmi-1敲除可能成为肿瘤化疗的潜在临床策略。

 

　　其它

 

　　与术前放化疗敏感性有关的分子靶标还有：GST-л(glutathiones-transferase-pi)、P-gp(P-glicoprotein)、TS(thymidylatesynthase)、MT(metallothionein)、CyclinD1等.这些标志物中，MT和GST-p及P-gp可能与DDP(cisplatin)的解毒功能和耐药性的产生有关；TS可能与5-FU的解毒功能和耐药性的产生有关。较多作者报道术前食管癌组织p53蛋白或/和血清中p53-Ab阳性的食管癌患者尤其伴有MT或GST-л高表达者，术前放化疗敏感性更差。D’Amicoetal对食管癌疗前食管镜检组织行免疫组化染色研究发现，GST-p和P-gp的过度表达可能为化疗耐药标志。此外，Samejimaetal报道术前活检组织CyclinD1过度表达放化疗敏感性差。

 

　　在手术切除的食管癌组织中或食管癌患者的血液中寻找与食管癌预后相关的分子靶标还有：细胞增生及细胞周期相关因子（Ki-67、CyclinD1）；细胞解毒功能相关因子（GST-p、P-gp、TS、MT）；细胞黏附和转移相关因子（nm-23,CD44,细胞粘和素E）；其他(S-VEGF,CRFRA21-1,SCC,CEA,C-反应蛋白,MVD)。发现预示食管癌较差预后者：MVD,CyclinD1高表达,nm-23蛋白免疫组化染色阴性，Ki-67LI(Ki-67labellingindex)>45%,MT、P-gp和GST-p及TS高表达等;血清中CYFRA21-1>1.5mg/L或>2mg/L,C-反应蛋白。

 

　　小结

 

　　虽然食管癌预后评价和疗效预测因子的研究报道颇多，但是真正单独应用时具有临床应用价值者却甚少。在如何将现有研究成果转化为临床实践应用，Shiozaki的做法确实值得借鉴。因发现预示较差预后的分子靶标在食管癌组织中或患者血清中表达愈多,预后愈差。作者据癌组织中表达预示较差预后标志物的多少将食管癌分为MG1至MG44类,MG1-MG4的5年生存率分别为:83%、54%、17%、0%。这种分子分类法作为临床TNM分期补充应用于临床，会更准确地判断患者的预后和为综合治疗提供正确的依据。评价现有分子靶标的临床价值，探索发现食管癌特异相关蛋白是该领域进一步研究的方向。