【体外研究】：碳酸氢钠对口腔生物膜的物理性破坏
JonathanPratten，JoannaWiecek，NicolaMordan，NishaPatel，DavidSpratt，AndrewMiddleton
研究目的
用已建立的恒定厚度生物膜发酵装置（CDFF）代表菌斑体外模型系统，量化与可视化碳酸氢钠对口腔生物膜的破坏，从而阐明碳酸氢钠的作用机制。
研究处理方案
将生物膜置于不同浓度的微细碳酸氢钠中测试2分钟（代表标准的刷牙时间）：
8%碳酸氢钠溶液
17%碳酸氢钠溶液
33%碳酸氢钠溶液
67%碳酸氢钠溶液
对照：磷酸缓冲液（PBS）(0%碳酸氢钠)
研究方法与材料
培养液：收集15例受试者的等量唾液样本混合，加入丙三醇制成混合储备培养液（终浓度为10%，v/v）。
体外模型参数：
-将恒定厚度生物膜发酵装置（CDFF）置于培养箱中，恒温在36°C（代表口腔）。
-用直径为5mm的羟基磷灰石圆板模拟牙齿表面，作为底层嵌入300μm深度以模拟厚厚的菌斑。
-取1ml混合的唾液培养液加入500ml的人工唾液中，随后将此混合液连续泵入CDFF中。保持有氧环境，将人工唾液作为生长介质，泵入速率为0.72L/天（代表人每天的唾液流速）。
生物膜处理：在灭菌条件下，将含有生物膜的羟基磷灰石圆盘从CDFF中取出，用4种碳酸氢钠溶液（8%、17%、33%或67%）中的一种或对照溶液处理2分钟，轻轻晃动。
培养分析：将培养物放入1ml含5颗玻璃珠的灭菌磷酸缓冲液中，迅速摇匀制成悬液。进一步将悬液进行连续稀释，点到苛养厌氧培养基中，计算总厌氧菌计数。
生物膜可视化：取分别含2μLBacLight？活/死细胞染色剂A和2μLBacLight？活/死细胞染色剂B的无菌蒸馏水加到羟基磷灰石圆盘上。黑暗中培养10分钟后，使用激光共聚焦显微镜（CLSM）检测生物膜。
电镜分析：用具有导电粘性并涂有碳涂层的铝针针尖蘸取生物膜进行25kV扫描电镜分析（SEM）。
研究结果
与对照组（0%碳酸氢钠）相比，各浓度的碳酸氢钠溶液对新形成不久的生物膜（2天）中的厌氧菌（生长不需要氧气的细菌）数均无任何影响。由于在新形成不久的生物膜中可能尚未形成表面多糖基质，因此这一结果支持了碳酸氢钠是通过破坏帮助细菌黏附到牙齿表面的表面多糖基质而发挥作用的假说。
与对照组相比，各浓度的碳酸氢钠溶液均可显著减少中位膜龄（7天）生物膜中的厌氧菌数，首次在体外试验中证实了碳酸氢钠对菌斑生物膜的物理性清除作用。
–67%碳酸氢钠的清除比例最高，清除的厌氧菌数至少是对照组的100倍。
–与新形成不久的生物膜相比，在较成熟的生物膜中有足够的时间形成表面多糖基质，碳酸氢钠对较成熟生物膜中菌斑的物理性破坏可能是因为碳酸氢钠破坏了表面多糖基质。
这是葛兰素史克可视化碳酸氢钠有效清除菌斑生物膜的首个体外研究
与对照组相比，各浓度的碳酸氢钠溶液均可减少成熟（14天）生物膜中的厌氧菌数，且作用相当。
试验中各浓度的碳酸氢钠均可有效清除中位膜龄和成熟生物膜中的菌斑
成熟生物膜的CLSM与SEM图显示，与对照生物膜相比，67%碳酸氢钠可清除大量的生物膜生长及其结构。在使用碳酸氢钠处理前，SEM图显示在成熟生物膜中有大量的多层结构，而在使用67%碳酸氢钠处理后多层结构变成了单层细胞。
结论
这是葛兰素史克可视化碳酸氢钠有效清除菌斑生物膜的首个体外研究。
有假说认为碳酸氢钠通过破坏表面多糖基质（细菌通过其粘附到牙齿表面）而有效清除菌斑，从而促进刷牙时对菌斑的物理性清除过程。
研究结果支持了碳酸氢钠破坏表面多糖基质的能力。
